الایزا ریدر

سيستم الايزا ريدر

الايزا ريدر يا خوانشگر الايزاكه به اسامي <ميكروپليت ريدر> و <خوانشگر ميكروپليت فتومتريك> نيز معروف است، يك اسپكتروفتومتر تخصصي بوده كه به منظور قرائت

نتايج تست اليزا طراحي شده است. اين وسيله به منظور تعيين حضور آنتي بادي ها يا آنتيژن هاي اختصاصي در نمونه ها به كار ميرود. اين تكنيك بر اساس تشخيص

يك آنتيژن يا آنتي بادي ها روي يك سطح جامد به صورت مستقيم يا ثانويه به كمك آنتي بادي هاي نشاندار و ايجاد محصولاتي استوار است كه ميتوانند توسط

اسپكتروفتومتر خوانده شوند. واژه الايزا ELISA،

اختصاري از كلمات Enzyme-Linked Immuno sorbent Assay است.



كاربرد ميكروپليت ريدر

مــيــكـــروپــلــيـــت ريــدر بــراي خــوانــدن نـتــايــج تستهاي الايزا مورد استفاده قرار مي گيرد. اين تـكـنـيــك كــاربــردي مـسـتـقـيــم در ايـمـنــولــوژي و سـرولـوژي دارد. از

مـيـان كـاربـردهـاي ديگر اين وسيله به تاييد حضور آنتي بادي ها يا آنتيژنهاي يك عامل عفوني در يك ارگانيزم، آنتي بادي هاي يـك واكـسـن يـا اتـوآنـتـي بـادي هـا بـراي

مـثال در آرتريت روماتوئيد مي توان اشاره كرد.


اصول كار

الايـزا ريـدر يـك اسپكتـروفتـومتـر اختصـاصي است. بر خلاف اسپكتروفتومترهاي معمولي كه قرائت جذب نوري را در گستره وسيعي از طول موج ها تسهيل مي كنند، الايزا ريدر داراي فسترها يا گريتينگ هاي انكساري بوده كه گستره طول موج ها را محدود كرده و معمولا بين 400 تا 750 نانومتر عمل مي كنند. برخي از الايزا ريدرها در

گستـره مـاوراء بنفـش عمـل كرده و قرائت را در مـحــدوده 340 تــا 700 نـانـومتـر انجـام مـي دهنـد. سـيـستم نوري موجود در اين دستگاه ها توسط تعدادي از كارخانه ها

با استفاده از فيبرهاي نوري به منظور تامين نور جهت چاهك هاي حاوي نمونه در ميكرو پليت طراحي مي شود. ابتدا يك شعاع نوري از نمونه اي كه داراي قطري بين 1

تا 3 ميلي متر است عبور كرده و سپس يك سيستم آشكار كننده، نور عبوري از نمونه را آشكار و تقويت مي كند. در مرحله بعد، سيگنال مربوط به جذب نوري نمونهها

ثبت شده و سيستم خوانشگر نيز آن را به اطلاعاتي تبديل مي كند كه سبب تفسير نتايج تست مي شوند. برخي از الايزا ريدرها با استفاده از سيستم هاي شعاعي

نوري دوتايي كار مي كنند.نمونه هاي مورد آزمايش در پليت هايي كه به اين منظور طراحي شده اند و داراي تعداد خاصي چاهك هستند، قرار مي گيرند. پليت هاي 8

ستوني همراه با 12 رديف كه در مجموع 96 چاهك را تشكيل مي دهند، رايج تر از بقيه هستند. براي كاربردهاي اختصاصي تر، تعداد چاهك ها افزايش مي يابد كه در

برخي موارد تا پليت هاي 384 چاهكي را نيز شامل مي شود. افزايش تعداد چاهك ها به منظور كاهش مقدار مصرف معرف ها و نمونه ها است. موقعيت سنسور نوري

الايزا ريدر بر اساس نوع كارخانه سازنده متغيير است؛ به طوري كه در موارد ممكن است در بالاي پليت حاوي نمونه و گاهي نيز مستقيما در زير پليت قرار گيرد. امروزه

ميكرو پليت ريدرها داراي كنترل هايي هستند كه به وسيله ميكروپروسسورها تنظيم شده اند.

وسايل لازم جهت انجام تكنيك الايزا

جهت انجام آزمايش الايزا تجهيزات زير مورد نياز است:

1- الايزا ريدر

2- ميكرو پليت واشر (شستشو دهنده چاهك ها)

3- سيستم توزيع كننده مايع (كه در اين مورد ممكن است از پيپت ها چند كاناله استفاده شود)

4- انكوباتور


مراحل مكانيكي انجام تكنيك الايزا

يك تست اليزا به طور رايج شامل مراحل زير است:

1- شستشوي اوليه پليت كه ممكن است با استفاده از ميكرو پليت واشر انجام شود.

2- استفاده از يك توزيع كننده مايع (ديسپنسر) يا پي پت چند كاناله.

3- پليت در انكوباتور قرار داده مي شود كه داراي دماي كنترل شده بوده و واكنش ها در آن محل انجام مي شوند.

بسته به نوع تست، مراحل 1، 2 و 3 ممكن است چـنـدين بار تكرار شوند، تا اين كه معرفهاي اضافه شده، واكنش ها را كامل كنند.

سـرانـجـام، وقـتـي تـمـام مـراحـل انـكوباسيون كامل شد، پليت به الايزا ريدر منتقل شده و سپس بـا قـرائـت جـذب نـوري نمونه ها، نتيجه آن ها مشخص مي شود.


مراحل بيوشيميايي تكنيك اليزا

1- چــــاهــــك هــــاي مــــوجــــود در پــلــيــــت بــــا آنـتــيبــاديهــا و آنـتــي ژن هــا پــوشـيـده (Coat) ميشوند.

2- نـمــونــه هـا، كـنـتـرل هـا و اسـتـانـداردهـا بـه چاهكها اضافه شده و در دماي اتاق يا 37 درجه سـانتيگـراد بـراي يـك مـدت زمـاني معين، طبق دستـورالعمـل تست

انكوبه مي شوند. در طول انكـوباسيون، بسته به حضور يا عدم حضور و مقدار آنتي ژن يا آنتي بادي موجود در نمونه، آنتي ژن نمونه به آنتي بادي كوت شده به پليت، يا

آنتي بادي موجود در نمونه به آنتي ژن Coat شده در پليت باند مي شود.

3- پـــس از انـكـــوبـــاسـيـــون، آنـتـــي ژنهــا يــا آنـتــيبــاديهــاي آزاد، شـسـتشـو داده شـده و بـا اســتــفـــاده از مـيـكــرو پـلـيــت واشــر و يــك بــافــر شستشوي

مناسب، برداشته مي شوند.

4- در مرحله بعد، يك آنتي بادي ثانويه، به نام كونژوگه، اضافه شده كه حاوي آنزيمي است كه به منظور ايجاد يك تغيير رنگي، با يك سوبسترا واكنش خواهد داد.

5- ســـپــــس يــــك دوره زمــــانــــي ثــــانــــويــــه از انـكــوبــاسـيـون شـروع مـي شـود كـه در طـي آن، كـونـژوگـه بـا كمپلكس آنتي ژن- آنتي بادي در چاهك ها پيوند

برقرار خواهد كرد.

6- پس از انكوباسيون، يك دوره شستشوي جديد انجام مي شود كه سبب برداشت كونژوگه متصل نشده از چاهك ها خواهد شد.

7- در مرحله بعد، سوبسترا اضافه مي شود. آنـزيـم بـا سـوبستـرا واكنش خواهد داد و سبب تغيير رنگ محلول خواهد شد. اين واكنش نشان خواهد داد كه چه مقدار

كمپلكس آنتيژن- آنتي بادي در پايان تست وجود خواهد داشت.

8- وقتي كه زمان انكوباسيون كامل مي شود، يك معرف براي توقف واكنش آنزيم- سوبسترا به آن اضافه شده كه از تغييرات بيشتر در شدت رنگ ايجاد شده، جلوگيري

ميكند. اين معرف عموما يك اسيد رقيق است.

9- در پايان، پليت بوسيله الايزا ريدر خوانده مي شود. نتايج حاصله براي تعيين مقادير اختصاصي يا حضور آنتي ژن ها يا آنتي بادي ها در نمونه به كار برده مي شوند.

تــوجـه: بـرخـي از چـاهـك هـا بـراي استـانـداردهـا و كنتـرل هـا استفـاده مـي شـونـد. استانداردها براي تعريف نقاط cut-off به كار برده مي شوند. استانداردها و كنترل

ها مـقـادير معيني هستند و براي اندازه گيري نتايج تست و ارزيابي اطلاعات در مقابل غلظتهاي مشخصي براي هر كنترل به كار برده مي شوند. فرايند توصيف شده در

بالا عمومي است؛ اگرچه بسياري از تست هاي الايزا وجود دارند كه همراه با مراحل يا متغيرهاي اختصاصي هستند.

نصب تجهيزات

به منظور عملكرد صحيح الايزا ريدر، نكات زير لازم است تا رعايت شود:

1- يك محيط تميز و عاري از گرد و غبار

2- يك ميز كار ثابت و به دور از تجهيزاتي از قبيل سانتريفوژ، شيكر و ... كه سبب لرزش آن مي شوند. اين ميز بايد داراي اندازه مناسبي باشد به طوري كه در كنار الايزا

ريدر، فضاي كاري مناسبي وجود داشته باشد. تجهيزات تكميلي مورد نياز براي انجام تكنيك توصيفي بالا عبارتند از: واشر، انكوباتور، ديسپنسر و كامپيوتر همراه با

وسايل جانبي آن.

3- يك منبع تغذيه الكتريكي، كه سازگار با استانداردها و معيارهاي كشور باشد. در كشورهاي آمريكايي به طور مثال، عموما فركانس هاي 60 هرتز و 110 ولت استفاده

ميشود، در حالي كه در نواحي ديگر از جهان 220 تا 240 ولت و 50 تا 60 هرتز به كار برده مي شود.

كاليبراسيون الايزا ريدر كاليبراسيون الايزا ريدر، يك مرحله اختصاصي است كه بايد توسط يك تكنسين يا مهندس آموزش ديده كه به دستورالعمل هاي سازنده دستگاه

آشنايي دارد، انجام شود. بـراي انجـام كاليبراسيون، داشتن يك مجموعه از ف3ترها كه از لحاظ اندازه، يكسان هستند، الزامي است. سازندگان اين دستگاه ها، پليت

هاي كاليبراسيون را براي هر طول موجي كه دستگاه به كار مي برد فراهم مي كنند.

پليت هاي كاليبراسيون مجهز به حداقل سه مقدار جذب نوري از قبل تعيين شده (پايين، متوسط و مقدار بالا)، در دامنه اندازه گيري هستند.

براي انجام كاليبراسيون مراحل زير را بايد دنبال كرد:

1- پليت كاليبراسيون را روي دستگاه قرار دهيد.

2- يـك خـوانـش كـامـل را بـا پليـت كـاليبراسيون انجام دهيد. مشخص كنيد كه آيا تفاوتهايي در قرائت هاي به دست آمده از يك چاهك به چاهك ديگر وجود دارد يا خير.

چنانچه اختلافي مشاهده شد، پليت را به اندازه 180 درجه چرخانده و قرائت را مجددا تكرار كنيد تا از اختلافاتي كه به خود پليت نسبت داده مي شوند، جلوگيري كنيد.

به طور كلي، اگر نتايج پليت در دو طول موج، به ميزاني باشد كه انتظار داريم، گفته ميشود كه دستگاه به كاليبراسيون ديگري احتياج ندارد.

3- تاييد كنيد آيا خوانشگر به كاليبراسيون احتياج دارد يا خير. چنانچه به كاليبراسيون احتياج دارد، راهنمايي هاي رايج كارخانه سازنده دستگاه را براي كاليبراسيون

دنبال كنيد. تاييد كنيد كه خطي بودن )linearity( خوانشگر تا حد امكان قابل قبول است.

4- اگــر دستگـاه حـاوي يـك پليـت كـاليبـراسيـون نيسـت، يـك محلـول رنگـي را در چاهكهاي يك پليت از آن ريخته و فوري نتايج را قرائت كنيد. سپس پليت را به اندازه

180 درجه چرخانده و دوباره قرائت را انجام دهيد. اگر هر دو خوانش ها و ميانگين مقادير در هر رديف يكسان هستند، خوانشگر كاليبر است.

5- تاييد كنيد كه خوانشگر به صورت ستون به ستون نيز كاليبر است. يك پليت تميز و خالي را در محل مخصوص قرار دهيد و قرائت را انجام دهيد. اگر اختلافي بين هر يك

از خوانش هاي ميانگين از اولين تا آخرين ستون وجود ندارد، مي توان فرض را بر اين گذاشت كه خوانشگر كاليبر است.

حفظ و نگهداري رايج

نـگـهــداري اســاســي (تـكـرار بـه صـورت روزانه)

1- مـرور ايـنـكـه سنسورهاي نوري هر كانال تـمـيـز هـسـتـنـد. چـنـانـچـه كـثـيـف هـستند، سطح پنجرههاي عبور دهنده نور و سنسورها را با يك برس كوچك تميز كنيد.

2- تاييد كنيد كه سيستم نوري تميز است.

3- تاييد كنيد كه كاليبراسيون خوانشگر كافي اسـت. وقـتـي كـارهـاي روزانه شروع مي شود، اجـازه دهـيد تا خوانشگر براي مدت 30 دقيقه گرم شود. در مرحله بعد،

قرائت Blank را انجام دهـيـد و سـپـس يـك پـليت كامل از سوبسترا را قـرائـت كـنـيـد. خـوانـش هـا مـي بـايـست يكسان بـاشند. اگر اين طور نبود، پليت را چرخانده و

قرائت را به منظور تعيين اين كه آيا اختلاف در پليت يا در خوانشگر است، تكرار كنيد.

4- سـيـسـتــم كـشـنــده اتــومــاتـيــك اســلايــدهـا (Automatic drawer sliding system) را بــررسـي كنيد كه بايد نرم و ثابت باشد.

نـگـهـداري بـازدارنـده (تـكـرار هـر سه ماه يكبار)

1- پـــايـــداري لامـــپ را تـــايـيــد كـنـيــد. پـلـيــت كاليبراسيون را به كار برده، قرائت را با فاصله 30 دقيقه مجددا با همان پليت انجام دهيد. قرائت ها را مقايسه كنيد كه

هيچ تفاوتي نبايد ميان آن ها مشاهده شود.

2- سيستم نوري دتكتور و سيستم هاي نوري را تميز كنيد.

3- كشنده پليت (Plate drawer) را تميز كنيد.

4- مكان قرار گيري هر چاهك را با استفاده از سـيـسـتـم هـاي انتشار نور و آشكار كننده تاييد كنيد


منبع:

medicinebiochemistry - persianlab.com